Neue setup ermöglicht die EPR-Studien, die auf kleine protein-Kristalle

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Quelle: © Jason W Sidabras et al/AAAS

Die verstärkte EPR war in der Lage, Ihnen neue Informationen zu [FeFe]-hydrogenase – ein Enzym von Interesse in der Energie-Forschung-Dank seiner Fähigkeit, Wasserstoff zu produzieren

Ein-Elektronen-paramagnetische-Resonanz (EPR) – Methode, dass arbeitet mit nanolitre Volumen Kristalle könnten, herauszufinden, welche neuen Informationen über Enzyme, ohne die Notwendigkeit für große und schwierig zu wachsen Kristalle. Die Technik basiert auf einem speziellen resonator-geometrie, kann verwendet werden, um EPR-Experimente bei sehr kleinen protein-Kristalle, wie Sie beispielsweise Häufig für den x-ray crystallography. Die neue setup-ermöglicht detaillierte Untersuchungen auf weit mehr Proteine als bisher möglich.

Viele wichtige biochemische Prozesse untersucht werden können mithilfe von EPR. Die Technik ist besonders nützlich für das Studium von Enzymreaktionen, denn es können wertvolle Informationen über die elektronische Struktur der aktiven Stelle. In einem typischen ESR-experiment, eine eingefrorene Lösung des biomoleküls in einem Mikrowellen-Hohlraum – eine Art von resonator – aber die Menge der Informationen, die in dieser Weise begrenzt ist. Obwohl die Einkristall-EPR-Experimente konnte mehr Daten, diese Methode wird selten angewandt, um protein-Systemen aufgrund der Herausforderungen im Anbau geeigneter Kristalle. Viele Proben verwendet werden, die in x-ray crystallography haben Abmessungen in der 0.05–0.3 mm-Bereich, aber Kristalle dieser Größe sind zu klein, um untersucht werden, die mithilfe von kommerziellen EPR-Spektrometer.

Forscher in Deutschland haben nun einen Weg gefunden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen von EPR-Experimenten um einen Faktor von bis zu 28 durch den Austausch der Mikrowellen-Resonator mit herkömmlichen setups mit einem self-resonant microhelix, die darin besteht, eine kleine eng gewundene Feder aus Silber Draht. ‘Man kann sich denken, dass es ein Objektiv für den magnetischen Fluss, dass ist so konzipiert, dass Sie den Füllfaktor für sehr kleine Proben”, sagt Jason Sidabras am Max-Planck-Institut für Chemische energiekonversion. In einem EPR-experiment, die Probe in Wechselwirkung mit den magnetischen Fluss und damit ergibt sich das signal gemessen durch das instrument. “Wenn die Stichprobe ist zu klein, wir brauchen einen Weg, um eine Konzentration des magnetischen Flusses auf. Die microhelix tut das sehr gut,’ Sidabras sagt. “Aufgrund Ihrer Größe und Form, es hat eine bestimmte elektromagnetische Resonanz-Frequenz. Man nennt es “self-resonant”, weil der Resonanzfrequenz kommt direkt aus der geometrie.’

Das team testete die neue Methode auf winzige Kristalle von [FeFe]-hydrogenase – ein Enzym von Interesse in der Energie-Forschung, weil es katalysiert die Produktion von Wasserstoff aus Protonen und Elektronen. “Ein wichtiges Merkmal dieses Systems ist der so genannte g-tensor,’ Sidabras sagt. “Für die erste Zeit, wir haben gemessen, dass diese Menge in der [FeFe]-hydrogenase. Dies erforderte die Experimente durchgeführt werden, mit einzelnen Kristallen des Enzyms. Bisherige Studien verwendeten sehr großen Kristallen bis 1 mm oder größer – und lange Messzeiten. Mit diesem neuen setup, Experimente, würde es Wochen dauern, können jetzt durchgeführt werden, in Tagen.’

“Das ist ein wirklich schönes technologische Verbesserung”, sagt Stefan Stoll von der Universität von Washington, USA, die war in der Studie nicht beteiligt. ‘Kristalle von Proteinen sind immer sehr klein, und bis jetzt EPR war nicht empfindlich genug, um Signale aus wie Kristalle. Nun, das ist möglich!’

Dimitri Svistunenko an der University of Essex, UK, stimmt zu. ‘Solch ein Fortschritt in der Methodik ist besonders vielversprechend, weil es erlaubt, über die EPR-Daten der x-Kristallographie-Daten, die auf der gleichen charge von mikrokristalle. Dies hilft zu verstehen, wie Enzyme arbeiten bei der Betrachtung aus verschiedenen Blickwinkeln betrachten”, sagt er.

Referenzen

J W Sidabras et al, Sci. Adv., 2019, 5, eaay1394 (DOI: 10.1126/sciadv.aay1394)